根尖牙乳头干细胞摄取外泌体的介导途径

更新时间:2023-05-28

【摘要】目的:探讨根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)摄取牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)外泌体的作用,为揭示其内吞外泌体的途径提供依据。方法:(1)采用超速离心法结合超滤法提取DPSCs外泌体,采用透射电镜观察法、纳米粒子示踪分析法以及Western Blot对其进行鉴定。(2)采用PKH-26膜标记技术标记DPSCs外泌体,37℃条件下将其与SCAP共培养作为阳性对照组,4℃条件下将其与SCAP共培养作为低温处理组,同时设置阴性对照组。采用免疫荧光染色法观察不同培养温度条件下SCAP内红色荧光标记情况。(3)通过胞吞抑制方法观察SCAP摄取外泌体的胞吞途径,分别采用10μmol/L氯丙嗪(chlorpromazine,CPZ,抑制网格蛋白介导的胞吞途径)作为CPZ组、200μmol/L金雀异黄素(genistein,抑制小窝蛋白介导的胞吞途径)作为Genistein组、50μmol/L LY294002抑制巨胞饮(macropinocytosis)作用作为LY294002组处理SCAP,将PKH-26标记的DPSCs外泌体与SCAP共培养,同时设置溶剂对照组(添加与抑制剂组等量的DMSO),采用免疫荧光染色技术观察SCAP内红色荧光标记情况和流式细胞技术分析有红色荧光标记的SCAP百分比。结果:(1) DPSCs外泌体形态呈茶托样,具有双层膜结构,粒径峰值为144 nm,能够表达肿瘤易感基因(tumor susceptibility gene、TSG) 101蛋白、CD63蛋白,二者皆为外泌体标志蛋白,符合外泌体特征。(2)免疫荧光结果显示,37℃共培养6 h后可见SCAP内有大量红色荧光(PKH-26)标记,而4℃共培养6 h后,SCAP内未见明显红色荧光(PKH-26)标记。(3)免疫荧光结果显示胞吞抑制后,SCAP内部红色荧光(PKH-26)标记减少,流式结果显示阳性对照组红色荧光标记的SCAP占35.0%,阴性对照组红色荧光标记的SCAP占0.5%,溶剂对照组红色荧光标记的SCAP占29.7%,CPZ组、Genistein组、LY294002组分别下降至13.7%、16.6%、20.9%。结论:SCAP能够摄取DPSCs外泌体,低温可影响该摄取过程; SCAP摄取外泌体主要依赖网格蛋白介导的胞吞途径、小窝蛋白介导的胞吞途径以及巨胞饮途径。

【关键词】 牙髓干细胞 根尖牙乳头干细胞 外泌体 胞吞途径

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